Độ tương phản trong kính hiển vi: Yếu tố quyết định khả năng phân biệt các chi tiết (phần 3)

Ở bài trước, chúng ta đã tìm hiểu về độ phân giải và biết rằng đây là yếu tố quyết định khả năng phân biệt hai chi tiết rất gần nhau. Tuy nhiên, một hệ thống quang học có độ phân giải cao vẫn chưa đủ để tạo ra một hình ảnh hữu ích. Nếu mẫu vật không đủ độ tương phản (contrast), nhiều cấu trúc quan trọng sẽ gần như “biến mất” trước mắt người quan sát.

Độ tương phản:

Trong kính hiển vi, độ tương phản là sự chênh lệch cường độ ánh sáng giữa hình ảnh của mẫu và nền, so với cường độ của nền, giúp tăng khả năng phân biệt một chi tiết của mẫu vật so với nền hoặc các cấu trúc lân cận.

Có thể biểu diễn bằng công thức:

Percent Contrast = [(I_b – I_s)/I_b] x 100

Trong đó:

• Ib: cường độ ánh sáng của nền (background intensity)
• Is: cường độ ánh sáng của mẫu (specimen intensity)

Nếu mẫu tối hơn nền, ảnh được gọi là độ tương phản dương (positive contrast). Ngược lại, nếu mẫu sáng hơn nền sẽ tạo thành độ tương phản âm (negative contrast). Ngoài sự khác biệt về độ sáng, sự khác biệt về màu sắc cũng góp phần tạo nên độ tương phản của hình ảnh.

Khi nền rất tối (I(b) = 0,01 – đường màu đỏ), chỉ cần một thay đổi nhỏ về cường độ sáng của mẫu cũng tạo ra sự thay đổi rất lớn về độ tương phản. Điều này giúp các chi tiết của mẫu trở nên nổi bật hơn. Khi nền sáng hơn (I(b) = 0,10 – đường màu xanh lá), độ tương phản vẫn tăng theo sự thay đổi cường độ của mẫu, nhưng ở mức vừa phải và phù hợp hơn cho việc quan sát. Khi nền có cường độ sáng cao (I(b) ≥ 0,50 – đường màu xanh dương), ngay cả khi cường độ sáng của mẫu thay đổi đáng kể thì độ tương phản chỉ thay đổi rất ít, khiến các chi tiết trở nên khó nhận biết hơn (hình 1).

Phương pháp tăng độ tương phản:

Độ tương phản không phải là đặc tính vốn có của mẫu vật, mà được tạo ra từ sự tương tác giữa ánh sáng, mẫu vật và hệ thống quang học của kính hiển vi. Điều này giải thích vì sao cùng một mẫu, nhưng khi quan sát bằng các kỹ thuật khác nhau sẽ cho hình ảnh hoàn toàn khác nhau. Có nhiều phương pháp để cải thiện độ tương phản, nhưng không phải phương pháp nào cũng tối ưu.

1. a) Nhuộm màu

Đây là phương pháp truyền thống và phổ biến nhất. Thuốc nhuộm làm tăng khả năng hấp thụ ánh sáng của các cấu trúc tế bào, tạo ra sự khác biệt rõ rệt giữa nhân, bào tương hoặc các thành phần khác. Ví dụ điển hình là nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E) trong giải phẫu bệnh. Nhược điểm là mẫu thường phải được cố định hoặc xử lý hóa học, không phù hợp cho quan sát tế bào sống.

Hình 2: mô giải phẫu bệnh nhuộm HE được chụp bởi kính hiển vi Nikon

1. b) Sử dụng các kỹ thuật quang học

Đối với các mẫu sống hoặc mẫu trong suốt, các kỹ thuật quang học là giải pháp hiệu quả nhất vì không cần nhuộm mẫu (hình 3). Một số kỹ thuật phổ biến gồm:

• Phản pha (phase contrast): phù hợp với tế bào sống và mẫu trong suốt.
• DIC (differential interference contrast): tăng độ nổi và làm rõ các chi tiết có sự thay đổi chiết suất.
• Nền đen (darkfield): lý tưởng cho các hạt nhỏ hoặc các chi tiết lông/tơ của vi sinh vật.
• Phân cực (polarized): dành cho các vật liệu có tính lưỡng chiết.
• Huỳnh quang (fluorescence): mang lại độ tương phản rất cao nhờ chỉ ghi nhận tín hiệu phát huỳnh quang từ các phân tử được đánh dấu.

* Chi tiết về các kỹ thuật quang học này sẽ được trình bày rõ hơn ở các phần sau.

Hình 3: hình minh họa gồm ba ảnh được chụp ở chế độ ánh sáng truyền trên cùng một trường quan sát, chứa mẫu tảo sợi Zygnema trong suốt và gần như không màu. (a) trường sáng; (b) phản pha; (c) DIC.

Trên thực tế, độ tương phản không đồng nhất trên toàn bộ ảnh mà thay đổi theo từng vùng của trường quan sát. Với mẫu sống hoặc mẫu trong suốt, kỹ thuật trường sáng thường chỉ tạo ra 2-5% độ tương phản, khiến nhiều cấu trúc khó nhận biết. Các kỹ thuật như phản pha và DIC cải thiện đáng kể khả năng hiển thị, nâng độ tương phản lên 15-20% mà vẫn giữ nguyên độ phân giải. Mặc dù thấp hơn nền đen (≈60%) và huỳnh quang (≈75%), hai kỹ thuật này vẫn là lựa chọn tối ưu để quan sát mẫu sống vì không cần nhuộm màu hay xử lý mẫu trước khi quan sát.

1. c) Điều chỉnh khẩu độ tụ quang

Ngoài các kỹ thuật tăng quang học trên, ta có thể thu nhỏ khẩu độ tụ quang (condenser aperture diaphragm) để tăng độ tương phản. Tuy nhiên, khi giảm khẩu độ tụ quang, độ tương phản tăng nhưng đồng thời khẩu độ số của hệ chiếu sáng cũng giảm. Hệ quả là độ phân giải giảm; hình ảnh mất độ sắc nét; xuất hiện các hiện tượng nhiễu xạ không mong muốn. Vì vậy, chỉ nên sử dụng cách này khi đã thực sự hiểu rõ về mối liên hệ giữa độ phân giải và độ tương phản cũng như đặc tính của mẫu quan sát.

Độ phân giải cao nhưng độ tương phản thấp vẫn chưa đủ

Một quan niệm sai lầm khá phổ biến là chỉ cần vật kính có NA cao hoặc camera nhiều megapixel sẽ cho hình ảnh đẹp. Thực tế, nếu độ tương phản quá thấp, nhiều chi tiết tuy đã được hệ quang học phân giải nhưng vẫn không thể nhận biết bằng mắt người hoặc camera. Ngược lại, một hệ thống có độ tương phản tốt sẽ giúp các cấu trúc trở nên rõ ràng hơn mà không nhất thiết phải tăng độ phóng đại.

Chính vì vậy, chất lượng hình ảnh trong kính hiển vi luôn phụ thuộc vào ba yếu tố cơ bản: độ phân giải, độ phóng đại và độ tương phản. Ba yếu tố này bổ sung cho nhau và đều cần được tối ưu để thu được hình ảnh có giá trị phân tích.

Kết luận

Độ tương phản là cầu nối giữa khả năng tạo ảnh của kính hiển vi và khả năng nhận biết của người quan sát. Một hệ thống có độ phân giải cao sẽ không phát huy hết giá trị nếu hình ảnh thiếu tương phản. Vì vậy, việc lựa chọn đúng kỹ thuật tạo tương phản, điều chỉnh hệ thống chiếu sáng hợp lý và sử dụng phương pháp quan sát phù hợp với từng loại mẫu là yếu tố quan trọng để khai thác tối đa hiệu năng của kính hiển vi.

Tham khảo: https://www.microscopyu.com/techniques/phase-contrast/specimen-contrast-in-optical-microscopy

Tìm đọc thêm: phase contrast, DIC, darkfield, polarized, fluorescence

VÌ SAO NÊN CHỌN MUA KÍNH HIỂN VI TẠI NIVINA?

• Hàng sẵn kho – Giao hàng nhanh: Tiết kiệm thời gian chờ đợi order, đáp ứng tiến độ khẩn cấp của các dự án và phòng Lab.

• Cam kết chính hãng: Đầy đủ chứng nhận CO, CQ, bảo hành chính hãng từ Nikon.

• Đội ngũ kỹ sư chuyên môn cao: Đội ngũ kỹ thuật của NIVINA được đào tạo bài bản trực tiếp từ hãng, sẵn sàng hỗ trợ lắp đặt, hiệu chuẩn (Calibration) và hướng dẫn sử dụng chuyên sâu tận nơi.

Liên hệ ngay với NIVINA để nhận tư vấn kỹ thuật chuyên sâu và báo giá ưu đãi tốt nhất cho các dòng kính hiển vi Nikon Eclipse!

Chúng tôi hiện sẵn kho các dòng kính hiển vi NIkon trên, liên hệ: 086-986-5068 Ngoài ra có dịch vụ Hiệu Chuẩn Quốc Tế ISO17025:2017 và VILAS1336